суббота, 6 февраля 2016 г.

Новости из мира РНК.

Не секрет, что изучать то, что стабильно, надежно детектируется, присутствует в достаточных количествах, хорошо воспроизводится гораздо легче, чем то, что едва уловимо, скоротечно, неустойчиво. Так же и в транскриптомике – основные усилия исследователей направлены на изучение зрелых форм мРНК, а вот чрезвычайно неустойчивые промежуточные формы (например, только-только зарождающиеся в процессе транскрипции молекулы пре-мРНК, или nascent RNA), которые существуют в клетке очень короткое время, остаются почти без внимания. И ключевая причина сего – отсутствие надежных и эффективных методов их изучения. Вот почему появление новых методов зачастую приводит к «взрыву» работ в таких областях.
По запросу “nascent RNAPubMed предлагает более 4300 ссылок, однако лишь незначительная часть из тех работ, на которые ссылается эта база, являются серьезными попытками изучения ранних событий в жизни РНК. Наиболее интересные работы в этом плане начали проводиться начиная с 2008 года, и связано это, как не сложно догадаться, с появлением новых методов анализа зарождающихся РНК: GRO-seq, PRO-seq, 3′NT и NET-seq. Последний из этих методов, NET-seq (от англ. Native Elongating Transcript sequencing), в первоначальном виде был предложен в 2011 году и апробирован на транскриптоме Saccharomyces cerevisiae. В 2015 году этот метод был приспособлен под изучение транскриптома клеток млекопитающих и человека, получив название mammalian NET-seq, или просто mNET-seq. А в этом году, в свежем номере журнала Nature protocols, появился методический обзор и подробный протокол по использованию этого метода для изучения зарождающихся молекул РНК. Базовая схема mNET-seq представлена на нижеследующем рисунке.

Схема процедуры mNET-seq
(источники: Nojima T. et al. Mammalian NET-seq analysis defines nascent RNA profiles and associated RNA processing genome-wide. // Nat Protoc. 2016 Mar;11(3):413-28. doi: 10.1038/nprot.2016.012.
Nojima T. et al. Mammalian NET-seq reveals genome-wide nascent transcription coupled to RNA processing. // Cell. 2015 Apr 23;161(3):526-40. doi: 10.1016/j.cell.2015.03.027).

Ключевыми этапами этого метода являются фиксация транскриптомных комплексов, осуществляющих элонгацию зарождающихся молекул РНК с помощью РНК полимеразы II, изоляция таких комплексов с помощью антител, специфически распознающих фосфорилированный С-концевой домен большой субъединицы РНК полимеразы II, выделение из них и фракционирование молекул РНК с последующим прочтением этих молекул по технологии RNAseq. Но это лишь ключевые этапы, а всего их там насчитывается 101 и растягивается сие удовольствие, по сообщению авторов, не менее чем на 6 дней, и то при условии, что исполнитель имеет хорошие навыки лабораторной работы (наверное, неопытные к такому делу не допускаются, денег жалко).

Комментариев нет:

Отправить комментарий