Не
секрет, что изучать то, что стабильно, надежно детектируется, присутствует в
достаточных количествах, хорошо воспроизводится гораздо легче, чем то, что едва
уловимо, скоротечно, неустойчиво. Так же и в транскриптомике – основные усилия
исследователей направлены на изучение зрелых форм мРНК, а вот чрезвычайно неустойчивые
промежуточные формы (например, только-только зарождающиеся в процессе транскрипции
молекулы пре-мРНК, или nascent RNA), которые существуют
в клетке очень короткое время, остаются почти без внимания. И ключевая причина
сего – отсутствие надежных и эффективных методов их изучения. Вот почему
появление новых методов зачастую приводит к «взрыву» работ в таких областях.
По
запросу “nascent RNA” PubMed предлагает более 4300
ссылок, однако лишь незначительная часть из тех работ, на которые ссылается эта
база, являются серьезными попытками изучения ранних событий в жизни РНК.
Наиболее интересные работы в этом плане начали проводиться начиная с 2008 года,
и связано это, как не сложно догадаться, с появлением новых методов анализа зарождающихся
РНК: GRO-seq, PRO-seq,
3′NT и NET-seq.
Последний из этих методов, NET-seq (от англ. Native Elongating Transcript sequencing), в первоначальном виде был предложен в 2011 году и апробирован на транскриптоме Saccharomyces
cerevisiae. В 2015 году этот метод был
приспособлен под изучение транскриптома клеток млекопитающих и человека, получив
название mammalian NET-seq, или просто mNET-seq.
А в этом году, в свежем номере журнала Nature
protocols, появился методический обзор и подробный
протокол по использованию этого метода для изучения зарождающихся молекул РНК. Базовая
схема mNET-seq представлена на
нижеследующем рисунке.
Ключевыми
этапами этого метода являются фиксация транскриптомных комплексов,
осуществляющих элонгацию зарождающихся молекул РНК с помощью РНК полимеразы II,
изоляция таких комплексов с помощью антител, специфически распознающих фосфорилированный
С-концевой домен большой субъединицы РНК полимеразы II,
выделение из них и фракционирование молекул РНК с последующим прочтением этих
молекул по технологии RNAseq. Но это лишь
ключевые этапы, а всего их там насчитывается 101 и растягивается сие
удовольствие, по сообщению авторов, не менее чем на 6 дней, и то при условии,
что исполнитель имеет хорошие навыки лабораторной работы (наверное, неопытные к
такому делу не допускаются, денег жалко).
Комментариев нет:
Отправить комментарий